细胞凋亡染色试剂盒(细胞Hoechst染色)

中文名称：细胞凋亡染色试剂盒(细胞Hoechst染色)说明书

英文名称：

产品规格：500T

发货周期：1～3天

此试剂盒是用于测定细胞增殖与毒性试验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。该试剂盒单溶液试剂包含一种四唑化合物[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,内盐；MTS]和一个电子耦合试剂(乙硫吩嗪，PES)。PES的化学稳定性已得到增强，这使它能与MTS混合形成一个稳定的溶液。

检测时，只需将少量MTS溶液直接加到检测板孔德培养基中，孵育1-4小时，然后酶标仪读取490nm的吸光度值就可，省掉了有机溶剂的溶解步骤，简化了实验过程，实验的灵敏度比其它如MTT,XTT高。

结果分析

1.细胞的存活率将各测试孔的OD值减去本底OD值（完全培养基加新型细胞增殖及毒性检测溶液，无细胞）或空白药物孔OD值（完全培养基加受试药物的不同稀释度加新型细胞增殖及毒性检测溶液，无细胞），各重复孔的OD值取均数±SD。细胞的存活率以T/C%表示，T为加药细胞的OD值，C为对照细胞的OD值。细胞存活率%=（加药细胞OD/对照细胞OD）×100

2.求出T/C=50%时的药物浓度(IC50)及T/C=10%时的药物浓度(IC90)。

实验报告：

一、分离与培养：

    1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，后将组织剪成1mm3左右大小；

    2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

    3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；

    4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

    5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；

二、荧光鉴定：

    1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%在室温条件下固定细胞15min；

    2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

    3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

    4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

    5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

    6、用PBS冲洗3次，每次10min，后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

培养操作步骤：

1．细胞凋亡染色试剂盒(细胞Hoechst染色)用盖片镊将盖玻片自75%乙醇中取出，用无菌丝绸布擦拭干净，不要用纱布； 

2．将盖玻片轻轻放入6孔培养板（每孔一片）或培养皿中（每个平皿可放置2-3片）； 

3．在距离紫外灯直射范围内20-30 厘米处照射2-3小时； 

4．将经过计数的细胞悬浮液移入培养板中，使盖玻片完全浸在培养液中； 

5．将培养板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，当贴壁细胞生长至覆盖培养板底部2/3面积时，将培养板取出，用盖片镊轻轻取出盖玻片，用蒸馏水漂洗后即可进行快速固定以及细胞化学检测。